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几种显微镜的使用方法和区别1.荧光技术
（1）荧光原理
荧光分子吸收入射光能量后,电子由基态跃迁到激发态。激发态电子不稳定,会自发跃迁回基态,并辐射荧光。辐射荧光λ＜入射光λ。
（2）荧光探针
①荧光素 如:罗丹明B
②荧光蛋白 如:绿色荧光蛋白（GFP）
（3）荧光分类
①自发荧光:如叶绿素、血红素等荧光分子经紫外线照射后,能够自发辐射红色荧光。
②诱发荧光:物质经荧光染料染色后,再经紫外线照射,进而辐射荧光。
2.荧光显微镜
（1）荧光显微镜概述
荧光显微镜是指利用短波长电磁波为光源,激发样品辐射荧光,之后利用样品产生的自发荧光或诱发荧光,对细胞内特异性蛋白质进行定性与定位研究的装置。
（2）荧光显微镜的特殊构件
①石英透镜
②滤光片系统
激发滤片,位于光源与样品之间,滤过可见光,只允许作为光源的紫外光通过。
（3）荧光显微镜的特点
①优点:荧光显微镜主要用于定性、定位研究细胞内特异性蛋白质。可以观察活细胞。
②缺点:无法排除来自样品焦平面以外的荧光,使得图像的反差与分辨率降低。
3.激光扫描共焦显微镜
（1）激光扫描共聚焦显微镜概述
激光扫描共焦显微镜是指以激光为光源,对样品进行逐点、逐行、逐面扫描成像的装置。其物镜与聚光镜共焦点,以提高分辨率。通过调节焦平面即可获得样品不同层次的图像,通过计算机分析和模拟,可以构筑样品的三维图像。
（2）激光扫描共焦显微镜的成像原理
①光源为激光,经双色镜反射后,通过物镜汇聚于样品某一焦点,激发荧光。样品所激发的荧光经透镜汇聚成像,通过共焦小孔被检测器检出。
②物镜与聚光镜共焦点,使得只有从样品焦平面发出的荧光聚焦成像,其他部分的激发荧光不能通过共焦小孔,检测器不能检出。
（3）激光扫描共焦显微镜的特点
①分辨率比普通荧光显微镜提高1.5倍。
②通过改变焦平面,可以获得样品不同层次的图像,从而可以构筑样品的三维图像。
③可以实现长时间活细胞动态观察。
一、透射电子显微镜
1.透射电子显微镜概述
透射电子显微镜（TEM）是指利用电子枪发出的高能电子束照射超薄样品,透射电子经电磁透镜多次放大后成像的装置。其原理为样品不同部分对电子束的散射程度不同。主要用于观察样品精细结构
透射电子显微镜的分辨本领是指电镜处于最佳状态时的分辨率。
2.透射电子显微镜的基本构造
（1）照明系统:电子枪、聚光镜
（2）成像系统:电磁透镜（物镜、中间镜、投影镜等）
（3）真空系统
（4）记录系统:荧光屏 or 感光底片
3.透射电子显微镜的样品制备
（1）超薄切片技术:固定→包埋→切片→染色
①固定:使样品的形态、结构与性质尽可能不发生变化。
固定剂的种类:锇酸、戊二醛、高锰酸钾
②包埋:使样品的精细结构在切片中得到支撑,获得的超薄切片连续完整并有足够的强度,耐电子轰击、耐高温、耐真空蒸发。包埋前常需脱水处理。
包埋剂的要求:
A.高倍放大时不显示本身结构
B.聚合时不发生明显收缩
C.具有良好的机械性能
包埋剂的种类:环氧树脂
③切片:切片厚度的调控通常通过金属热膨胀或机械伸缩。
④染色:通常通过重金属盐对样品染色以形成明暗差,得到黑白图像。
常用重金属盐
A.锇酸 - 脂质
B.铅盐 - 蛋白质
C.醋酸铀 - 核酸
（2）负染色技术
负染色技术是指对背景染色的技术。通过用重金属盐对铺展在载网上的样品染色,使电子密度高的重金属盐布满整个载网,而凸出载网表面的样品则没有染料沉积,从而使背景散射电子能力增强,而样品散射电子能力减弱,以此衬托出样品的精细结构。
负染色技术适合于观察生物大分子组成的结构,如:病毒、核糖体等。
（3）冰冻刻蚀技术
冰冻刻蚀技术主要用于观察膜断面表面形貌与膜断面蛋白质,样品无需包埋、固定,能够更好的反应样品的真实结构。
①冰冻断裂:在液氮中将样品迅速冷冻,之后在低温、真空环境下用冰刀将其切断。由于断面的冰在真空中少量升华,可以增强刻蚀效果。
②刻蚀复型:用金属铂进行倾斜喷涂,以形成电子反差,再用碳垂直于断面进行真空喷涂,形成连续碳膜,以复制样品的表面形貌。再用消化液消除样品本身,之后将之移到载网上用电镜观察。
二、扫描电子显微镜
1.扫描电子显微镜概述
扫描电子显微镜（SEM）是指利用高能电子束扫描样品,激发样品表面产生二次电子,进而依据样品不同部位产生二次电子数量的多少而成像的装置。主要用于观察样品表面形貌。
2.扫描电子显微镜的样品制备
（1）喷镀技术
在样品表面喷涂一层金膜,以增强其导电性。
（2）CO2临界点干燥法
将样品浸入液态CO2中,在临界温度之上使CO2以气态逸出,由于没有气液相面产生,因此不存在表面张力,故能够保持样品的表面形貌。
1.相差显微镜
（1）相差显微镜概述
相差显微镜是指利用光线的干涉、衍射特征,使相位差转变为振幅差,增强样品的明暗对比,从而观察无色透明样品的装置。
（2）相差显微镜的特殊构件:相差板、环状光阑
相差显微镜在物镜后装有相差板,相差板部分区域有吸光物质,使得光线分别通过相差板不同区域时相位差增大,汇聚后经叠加使振幅增大或减小。从而将相位差转变为振幅差,增强样品的明暗对比。
（3）相差显微镜的优点:样品无需染色,可观察活细胞及细胞器动态。
2.微分干涉显微镜
（1）微分干涉显微镜概述
微分干涉显微镜是指以平面偏光为光源,光源经棱镜后分为两束,在不同时间经过样品相邻部位,再经过另一棱镜后会合,从而使样品的厚度差转变为振幅差,增强样品的明暗对比,从而观察无色透明样品的装置。
（2）微分干涉显微镜的优点
①适合观察活细胞内较大的细胞器。
②分辨率比普通复式显微镜提高一个数量级。
3.录像增差显微镜
录像增差显微镜是指:在微分干涉显微镜的基础上引入计算机辅助录像,从而观察记录活细胞内细胞器活动的装置。如:颗粒在微管上运动。
文章出自：科信仪器 转载时必须以链接形式注明作者和原始出处及本声明。
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