荧光全内反射技术详解

大于临界角的光线从高密介质向低密介质时，在界面处并不是所有的光都被反射，而是有一部分光会穿透介质表面，到达低密介质内，但这部分光的强度会随着穿透深度的增加而成指数级迅速衰减，我们称这部分光为消逝波消逝波消逝波。全内反射荧光显微镜利用全内反射产生的消逝波场来照明样品，从而致使在百纳米级厚的光学薄层内的荧光团受到激发，荧光成像的信噪比大大提高。

细胞学研究中经常使用共聚焦显微镜研究薄层切片，但共聚焦的激发光要穿透整个标本，然后通过在采集端进行遮挡的方法采集薄层图象信息。受到光学显微镜衍射极限的限制，共聚焦显微镜的轴向分辨率约为350nm左右。共聚焦需要在荧光采集端进行阻挡和分光等设置，往往采集荧光的光路很长采集效率很低，因而需要使用较强的激发光去照射标本，标本的杀伤和荧光的漂白都很明显。另外共聚焦受到扫描速度和采集效率的限制往往采集图象速度较慢，不能快速的获得清晰的微弱荧光图象

TIRF的特点就是利用薄层激发，激发光能够照亮的范围只有百纳米级，因此更深层的荧光不会干扰我们要观察的表面信号，而且这种薄层激发对标本的杀伤也很小。TIRF显微镜采集信号时通常是直接使用离物镜最近的侧光口采集荧光，因此采集的荧光信号背景极低、荧光损失极小，也就是有很高的图象信号噪音比（信噪比、S/N）。TIRF技术通常使用量子效率达到90％的背感光高敏感度的EM-CCD，通过高效采集和高敏感的电子放大技术可以高速的获取极弱荧光图象。

TIRF技术非常适合活细胞相关的膜表面成像、囊泡运输、胞吞胞吐作用、病毒侵染和单分子荧光成像等相关研究。

 

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