显微镜数字化让病理学精确诊断

新问题层出不穷

病理学前所未有的发展也提出了许多新的问题让我们思考。组织结构和免疫组织化学表型相同的肺腺癌存在着不同的驱动基因，而普通型乳腺癌则具有不同的分子变化谱，东西方肝细胞癌则具有不同的病因以及不同的分子学发病通路。非常令人迷惑的是EwSRl基因。Ewing／PNET肉瘤是EWSRl基因与近十个不同基因融合的结果，但EwsRl基因与其他基因融合则可发生多种组织形态的软组织肿瘤；而同样的EwSRl．ATF融合则可出现在血管瘤样纤维组织细胞瘤和部分透明细胞肉瘤。即同一肿瘤可能由不同分子介导，而不同肿瘤可能有同一分子改变。这些事实提示肿瘤细胞分化方向与途径(即组织发生学或表型特征)可能与肿瘤驱动基因介导的过程是相互相对独立的事件。同时，肿瘤靶向治疗的实践表明，我们更应该注意那些同类肿瘤中仅在部分肿瘤表达和突变的分子，在传统的分析中由于统计学处理这类分子改变难以达到有统计学意义而通常被忽视。过去我们一般注意分子改变的普遍性，例如，在结肠癌或肺癌中只注意那些普遍存在的过表达的基因，现在看来今后的研究应当更加注意对观测指标分析的标准即阈值、终点的设置。这些问题也同样存在于现在对肿瘤预后因子的研究中，目前多数研究仍集中于确定具有普遍意义的预后预测因子，如果考虑到表型与分子事件之间的相对独立性，确定具有普遍意义的预后预测因子不一定具有可行性。事实上，目前发现的预后因子多数仅反应某些类型的预后意义就不难理解：如N-myc扩增仅仅反映部分神经母细胞瘤的预后。所以，预后因子可能与驱动基因有关，也具有类型的特异性。

对肿瘤的异质性的认识需要不断深化。过去病理学界对肿瘤异质性的关注只是着重于表型的异质性(分化与结构，或生物学行为)，而肿瘤靶向治疗实践显示这种表型的异质性似乎并不十分重要，而分子层面的异质性可能更值得探讨。那么分子的异质性性又应该从哪些方面考察呢？可能应考虑：(1)驱动基因突变方式：不同的突变方式与下游的活化状态，以及药物敏感性的差异；(2)驱动基因介导的信号通路基因改变；(3)p53、RB、PTEN、BRCAl、错配修复(MMR)等肿瘤抑制基因的状态；(4)肿瘤细胞遗传不稳定性：如基因组随机性改变，尤其是近年来新发现的染色体碎裂(chromothripsis)所引起的基因组异常；(5)与肿瘤微环境、代谢相关的调节机制；(6)在靶向治疗过程中检测到的“新发”突变，究竟确为新发，还是肿瘤异质性的结果(原先主宰肿瘤的优势克隆被抑制后，耐药克隆转变成主宰克隆)，还有我们尚未发现的因素。另外，常见的p53、RB、PrEN等肿瘤抑制基因以及RAS、myc癌基因涉及众多肿瘤，具有普遍性，且相关作用途径已经大致清晰，但目前仍缺乏作为靶点的有效干预手段。肿瘤增殖特性评估尚缺乏更好的指标，尤其是部分高度恶性肿瘤其Ki-67阳性指数不高，许多上皮性癌Ki-67的参考意义不大，表明对肿瘤细胞增殖特点的认识仍然十分局限。此外，肿瘤靶向治疗的实践也挑战我们的许多传统观念。其中，值得注意的是有关肿瘤恶性度的问题。这些年因为临床对部分肿瘤有了有效的治疗方法，尤其是乳腺癌、肺腺癌、黑色素瘤等恶性度较高的肿瘤，表明肿瘤的恶性度也具有相对性，是否具有有效的治疗手段，较单纯的恶性度判断更为重要。

原发肿瘤与其转移瘤的平行发生理论值得关注。肿瘤靶向治疗显示针对原发癌的有效药物对转移癌也同样有效，表明至少部分转移癌的分子特性依然保持着原发癌的特征。似乎转移性肿瘤的治疗并非像过去认为的那样困难。同时值得关注的是近年来肿瘤转移的研究进展，如肿瘤干细胞理论，转移与肿瘤发生的关系，即肿瘤转移可能伴随着其形成的全过程，这些对肿瘤病理检查、转移危险度、治疗效果判断、标志物的筛选均可能带来影响。对于这些问题我们目前尚无确切的答案，但发现这些问题则是解决的开端。

 

 

从图像分析软件到安装在手机上的无透镜显微镜，计算创新及其新的工具正在给病理学家们提供更清晰、更富含信息的图像。

 

然而，病理学依然是一门顽固的模拟的和定性的科学。经验丰富的病理学家的主要工具是载玻片——200多年几乎没有改变的复式显微镜外加一双眼睛。耶鲁医学院病理学家戴维·里姆（David Rimm）说：“病理学家的大多数医疗决策是根据形态学定义的。”也就是显微镜下细胞和组织的结构细节。

当然，方法的陈旧决不是放弃它的原因。但是，数字式病理学倡导者们担忧的是（决策）不一致会带来假阴性或误诊。比如，在鉴定罕见肿瘤时，有经验的病理学家往往比年轻人做得好，但是，彼此经常出现判断不一致，尤其是对同一个样品的不同评估，这是矛盾的。

数字式病理学早期提倡者、俄亥俄州立大学的生物医学信息学家梅廷·居尔坎（Metin Gurcan）认为，临床数字化的障碍在于图像的大小和其处理过程复杂性。首先，要将活检组织切成多个部分并放在多个载玻片上，一个载玻片在显微镜下放大得到的数字式图像大约有100亿个像素，需要30千兆字节的内存。例如，典型的前列腺穿刺活检使用20多张载玻片，需要大约600千兆字节。

接着，便是大量的数据等待着病理学家的扫描或软件的筛选。居尔坎说：“在这些图像中解读细胞数目和类型是令人难以置信的。”然而，一种与这种复杂性打交道的方法就是通过软件来识别和解读，就像人所做的那样，而且更快速、一致。

正如人们通过学习来掌握知识那样，软件也可以。2011年，哈佛医学院的病理学家安德鲁·贝克（Andrew Beck）建立了一种称为C-Path的学习软件，结合248名患者的乳腺癌活检图像和生存资料，该软件学习后可以给乳腺癌患者进行评分和预测其存活率。

在显微镜下观察活检组织，病理学家主要凭借癌细胞三个特有的特征来甄别肿瘤的攻击性：细胞核形状是否异常？细胞是否正在分裂？细胞彼此是否正常连接或分离？病理学家们将这些特征逐项量化后以此确定肿瘤级别及描述其攻击性如何。

而C-Path系统的工作原理是，将图像分割成“超像素”小区域，在每个超像素内鉴别细胞核和细胞质，并与邻近的超像素比对――颜色、纹理、大小和外形。对于乳腺癌，这种比对分析产生的特征与两种事物相关：样品的全结构和其精细比例细节，例如，癌细胞和正常细胞的细胞核之间的平均距离。

最后，C-Path得到的6 642个特征结构，在描述癌细胞自身的同时，还包括周围基质的连接组织。事实上，基质形态学比单独的癌症形态学具有更好的存活预测因子：基质区域形态一致与良好的预后有联系，而被上皮细胞浸润的基质，则指示程度较高的进展性癌症。基于对数千个特征结构的分析，C-Path做出了比标准的病理学分析更准确的患者存活率分析。贝克现在在更广范围样品中训练他的软件，包括全玻片图像和正常乳腺组织样品。

 

有可能的是，病理学家也会寻找到由C-Path计算出的数千特征结构中的一些特征，但却难以用词语来表述它们。比如，将一例确诊的肿瘤和在一幅照片中识别出你叔叔的经历进行比对。你不能确切地说清楚他是你叔叔――是他的鼻子、眼睛还是衣服？只知道这就是他。但是，计算机却可以量化分析一幅图像的特征，并且可以重复。

也有人认为，作为第二双犀利的眼睛，软件的正确用途应该是帮助医生从海量数据中寻找或对目标物进行分类，以此减轻他们的工作量。安阿伯市密歇根大学的病理信息学专家尤里西斯·巴利斯（Ulysses Balis）正在开发一种称为SVIQ的通用视觉搜索程序。

为了对SVIQ进行实证，巴利斯通过不同角度对大肠腺癌切片的数字式图像进行放大和缩小，如果他发现有趣的东西――比如一个看似正在分裂的细胞――并想在图像中搜索其他有相似特征的结构，就点击“扫描”按钮，软件随即将图像中相似的部分亮化，前后花费大约10秒时间。他说：“这可能是最简单的二维图像搜索结构，是一个良好的应急工具。”

与C-Path主要做诊断决策不同，SVIQ软件可以帮助病理学家在数字式病理学图像中发现兴趣位点。美国国立癌症研究所（NCI）从事病理信息学研究的贾森·希普（Jason Hipp）认为，病理学家们所能做的是逐个对视野中一些正在分裂的细胞进行计数，不同的是，SVIQ可以对整个组织切片内每个分裂细胞进行计数。因此，SVIQ在提高病理学家工作效率的同时，并提供更多的形态学数据。

希普的目标之一是将SVIQ整合进癌症患者的筛选过程中。通常这要从发现癌症患者的遗传学试验开始，对于那些分散在人体内的肿瘤，包括活检组织在内，一时很难发现足够的癌组织进行遗传学筛选。一般情况下，从取出活检组织到对其癌样部分鉴定和染色，过程大约为25分钟时间。通过SVIQ软件，病理学家从发现图像中某个区域的癌细胞，到亮化与其特征相似的其他结构部分，过程大约为5分钟。

在伦敦癌症研究所，生物信息学研究人员袁茵茵（Yinyin Yuan，音译）正在将肿瘤中所有细胞类型进行作图，旨在获得它们的基因表达数据。她说：“肿瘤内不同细胞群体产生的复杂景观，成为了精确诊断的障碍。”由于对肿瘤部分取样进行的测序不能捕获其全部图像，进而丢失了癌症－细胞群体的异质性，进一步影响到患者的预后和他们对不同治疗方案的应答。

2012年袁开发了一款软件，对取自300个乳腺癌组织活检全肿瘤载玻片的大约100万个细胞逐一进行分类，然后与其他“组学”数据进行集成（由100个计算芯片组成的计算机簇完成这项工作）。通过与其他肿瘤数据比对（该软件输出的是数据，不是图像），袁发现，那些免疫细胞渗入肿瘤的患者有更好的预后。当图像数据与基因表达数据连接时，这种预测得到了增强。当病理学家凝视基因表达数据清单时，这种结果并不明显，但当该软件分析图像时，就变得清晰了。目前，袁计划着将她的这项研究扩展到卵巢癌和肺癌中。

 

 数字式图像分析使病理学家工作变得轻松的同时，也催生新的硬件类型的产生，而制作数字式显微镜图像，则意味着需要较为昂贵的扫描显微镜镜片。目前，研究人员正在开发既扫描迅速又相对便宜的显微镜，旨在更多地提升软件功能、较少依靠透镜或其他硬件。

在传统显微镜中，低倍透镜是牺牲分辨率得到宽视野，而高分辨率则只能看到小的视野。在帕萨迪纳加州理工学院从事显微镜技术研发的杨长辉（Changhuei Yang，音译）说：“机械扫描相对缓慢。”他的解决方案是增加传统显微镜的视野和分辨率。2013年7月，杨长辉将一架低分辨率光学显微镜改装成一架高分辨率显微镜，进而可以用便宜的硬件制作全玻片图像——在0.8毫米的分辨率下观察到120平方毫米的面积。而标准显微镜在这个分辨率下只能提供1.1平方毫米的视野。  

更进一步的是，加州大学洛杉矶分校的电子工程师埃道甘·奥兹坎（Aydogan Ozcan）正在研发一款无透镜的显微镜，擅长处理生物学“湿件”样品，能够完成物理透镜所做的同样事情：将模糊的干涉模式转换成细胞的聚焦图像。在细节上，其致密显微镜与透镜显微镜完全一样，拥有数百纳米分辨率，可以清晰地显示细胞核。

与此同时，奥兹坎还在尝试众包他的诊断学仪器——将显微镜制作的血液细胞图像上传到一个连线游戏上（一个非专业人士认识感染疟疾的细胞的教学游戏），供众多游戏迷游戏，然后对答案做统计学综合。结果，这款游戏产生与病理学家相同诊断的次数比例达99%。奥兹坎认为，这款智能软件最终能从病理学家那里接管部分事务。

亚里桑那州凤凰城视觉门公司首席执行官艾伦·纳尔逊（Alan Nelson）认为，计算创新将会给病理学领域带来改变。目前，他正在研发针对血液中癌细胞三维成像的自动化检测系统。他说：“机器不会给出意见，它能产生的是数据和基于统计学的诊断。”该系统有望增加筛查速率，帮助病人更快地得到治疗。

纳尔逊曾是目前市场上唯一的自动化癌症筛查仪的首席发明人，其NeoPath公司研发的宫颈癌检测仪，在1996年获得美国食品和药品管理局（FDA）的批准——这款检测仪是专门为测定宫颈帕氏涂片内癌细胞而定制，载有数百片载玻片，可以终日进行自动化扫描。

当今的计算机已今非昔比。纳尔逊称，在软件的辅助下，显微镜可以向生物学家和医生展示以前他们从没看到的事物：奥兹坎的无透镜显微镜已经向人们展示了精子螺旋运动的新模式，视觉门公司的三维图像可以向病理学家展示数百种以前无法看到的特征结构。“我们可以清晰地看到肺癌细胞核内的表面纹理，或测量出六号染色体短臂的长度，我的上帝呀，真是太美了！”