超分辨率三种显微技术的研究

荧光显微镜和荧光显微技术：荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。荧光显微技术是应用短波光照射被测物质以激发其发射荧光从而在荧光显微镜下观察。
2、单分子荧光成像

当显微镜需要分辨两个或者更多点光源的时候，很难突破光学分辨率的极限来进行精确定位。而当显微镜的物镜视野下仅有单个荧光分子的时候，通过特定的算法拟合，此荧光分子位置的精度可以很容易超过光学分辨率的极限，达到纳米级。在同样的信噪比图像上，用高斯函数拟合单分子荧光的点扩散函数可以达到最佳的定位精度．Thompson 等科学家结合了理论推导和计算机模拟，综合考虑了各种因素的影响，如离散时间段检测到的发出光子数的泊松噪声、CCD 相机的背景读出噪声以及CCD 像素点的大小等，得到了单分子在二维定位精度上的近似公式： 其中x 为定位的误差，s 为点扩散函数的标准方差，a为CCD 像素的大小，N 为收集到的光子数，b 为背景噪声。

PALM和STORM：尽管单分子的定位精度可以达到纳米级，但它并不能提高光学显微镜在分辨两个或者多个点光源时的分辨率。2006年9月，Betzig和Lippincott-Schwartz 等在Science 上提出了光激活定位显微技术：是用PA-GFP 来标记蛋白质，通过调节405 nm 激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用488 nm 激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子．在确定这些分子的位置后，再长时间使用488 nm激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激活出来．之后，分别用405 nm 和488 nm激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环．这个循环持续上百次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精确定位．将这些分子的图像合成到一张图上，最后得到了一种比传统光学显微镜至少高10 倍以上分辨率的显微技术，如图所示，PALM 显微镜的分辨率仅仅受限于单分子成像的定位精度，理论上来说可以达到1 nm 的数量级。 PALM 的成像方法只能用来观察外源表达的蛋白质，而对于分辨细胞内源蛋白质的定位无能为力．2006 年底，美国霍华德- 休斯研究所的华裔科学家庄晓薇实验组开发出来一种类似于PALM的方法，可以用来研究细胞内源蛋白的超分辨率定位：随机光学重构显微技术：将Cy3和Cy5分子对胶联到特异的蛋白质抗体上，就可以用抗体来标记细胞的内源蛋白．应用特定波长的激光来激活探针，然后应用另一个波长激光来观察、精确定位以及漂白荧光分子，此过程循环上百次后就可以得到最后的内源蛋白的高分辨率影像。
3、STED（受激发射损耗显微技术）

用一束激发光使荧光物质(既可以是化学合成的染料也可以是荧光蛋白)发光的同时，用另外的高能量脉冲激光器发射一束紧挨着的、环型的、波长较长的激光将第一束光斑中大部分的荧光物质通过受激发射损耗过程猝灭，从而减少荧光光点的衍射面积，显著地提高了显微镜的分辨率． STED成像技术的最大优点是可以快速地观察活细胞内实时变化的过程，因此在生命科学中应用更加广泛。

将多重相互衍射的光束照射到样本上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨率的信息。

扫描隧道显微镜弱点

(1).对观察样品限制较多，例如样品必须是导体，不能是非导体和溶液等。

(2).对样品环境有严格要求，如要求高真空等。 

(3).对观察的对象都过多过少造成损害，而光学显微镜对样品的限制极少，可以是非导体或液体，可以是有生命的也可以实物生命的，可以是透明的也可以是不透明甚至发光的，不仅可以观察处于静态的样品还可以观察动态情况下的样品。至于样品环境更无特殊要求，可以使常温大气压，也可以是非常温和非常压的环境，观察对物体不造成损伤则更是光学显微镜的一大优点。
5、扫描隧道显微镜的工作原理

扫描隧道显微镜就是根据量子力学中的隧道效应与原理，通过探测固体表面原子中的电子的隧道电流来分辨表面形貌的显微装置。根据量子理论，由于电子的隧道效应，金属中的电子并不完全局限于金属表面之内，电子云密度并不是在表面边界处突变为零。在金属表面以外，电子云密度呈指数衰减，衰减长度约为1nm。用一个极细的、只有原子线度的金属针尖作为探针，将它与被研究物质（样品）的表面作为两个电极，当样品表面与针尖非常靠近（距离（1nm）时，两者的电子云略有重叠，若在两极间加上电压Vb，在电场作用下电子就会穿过两个电极之间的势垒，通过电子云的狭窄通道流动，从一极流向另一极，形成隧道电流I。隧道电流I的大小与针尖和样品间的距离S以及样品表面平均势垒的高度有关。关系式为：

 I∝Vbexp(-Aφ^(1/2) S)

类似于隐失波在界面上的衰减，高分辨率正是因为这种指数衰减对距离的敏感性。由此可见，隧道电流I对针尖与样品表面之间的距离S极为敏感，如果S减小0.1nm，隧道电流就会增加一个数量级，当针尖在样品表面上方扫描时，即使其表面只有原子尺度的起伏，也将通过其隧道电流显示出来。借助于电子仪器和计算机，在频幕上即显示出样品的表面形貌。