如何构建和提升显微镜

许多生物科学家都将他们的显微镜与照相机相连以进行记录并分析图像。如今的显微照相机，已经由电传感器取代了胶片。其中最早的一种传感器是电荷耦合元件，它利用像素矩阵捕获光线并将其转换为电信号。许多制造商仍在使用这种类型的传感器，它们是极其可靠的。

成本较低的互补金属氧化半导体则来源于集成电路产业。这种传感器也将光转换为电信号，但它需要在传感器上有更多的电路，这样就占用了感应的空间，因此这项技术通常比不上CCD的光线敏感度。然而，由于像素是集中检测而非单个检测，CMOS传感器可以得到比CCD传感器更快的帧率。CMOS的新版本——科学CMOS，通过在维持速度的情况下提供更强的敏感性，解决了该技术的缺陷。

然而，不同的应用常常决定了照相机哪一种独特的性能是必要的。“如果你在构建一种简单的显微镜，只为拍摄一个被H&E染色的样品照片，你不需要过分奢侈的照相机。”如果你需要更高的成像速率或者检测弱荧光信号的能力，Richardson说，“你可能会从一台价值2000美元的照相机升级到一台价值20000或30000美元的照相机。”前者可能是一个高端消费型CCD照相机，而后者则可能是个sCMOS照相机。

制造商也在继续通过各种感应器在显微照相机中谋求新的发展。

科学家在为显微镜配备相机时，可以从其他装载了16毫米对角线CCD的选择中做决定，例如由加拿大不列颠哥伦比亚省萨里市QImaging公司制造的Retiga 6000。QImaging的产品经理Chris Ryan介绍，这一照相机“的服务对象是那些想要扫描整张载玻片或同时监测大群细胞（如高容量筛选）的客户。”

例如，在荧光成像中，科学家考虑的是敏感性和分辨性，Ryan说。敏感性决定着可以检测出的最弱的荧光信号，而分辨性则显示了图像可以识别的最细微的特征。“那些特征是照相机与物镜的组合。”Ryan说。

在某些情况下，生物科学家可能倾向于具有一系列特征的照相机。若是如此，他们可能会选择sCMOS的照相机。例如，爱尔兰贝尔法斯特Andor技术公司的生命科学应用专家Orla Hanrahan提到了Andor的Zyla 4.2系统。“这台仪器可以提供敏感性、速度和广阔的视野，就像一台全能的照相机。”Hanrahan说。

然而，在低光成像中，研究者可能更倾向于电子倍增电荷偶联的照相机。EMCCD包括了能将常规CCD的输出结果倍增的电荷设备。因此，EMCCD可以检测微弱的信号。例如，美国亚利桑那州图森Photometrics公司的Evolve 512 Delta系统使用的就是EMCCD传感器。然而，Photometrics的产品经理Rachit Mohindra却指出了其中的缺点：“在如此低光水平下工作，EMCCD照相机使用的传感器像素更大，会在给定的范围内收集更多的光，因此你看不到更精准的细节。”

 

如今的生物科学家经常对活体细胞进行成像。传统上，科学家大多在观测死的细胞，这些细胞的制作过程会使样品非常健壮，能够在不受特殊关照的情况下保存若干年。与之相比，活细胞必须得到精心培养以使它们保持活性。美国加州卡尔斯巴德的生命科技公司高级研发经理Michael O'Grady说：“为了得到清晰的图像，你需要保持细胞的健康。”

为此，科学家必须在观测活细胞时维持特殊的环境条件。为了决定哪个设备为特殊的应用提供最优的条件，科学家可以咨询专家，例如美国伊利诺伊州维斯塔蒙特市McCrone显微镜及配件公司的仪器销售部总裁与主任Jeffrey D. McGinn。他说：“当有人联系到我们，我们会进行一些需求评估的问卷，例如咨询客户想要观测的样品类型，以及样品是否需要置于某种特定环境中。”因此，他可能建议配置一个温度控制的平台系统，如英国萨里市Linkam科学仪器公司所提供的平台。这些平台能够保持样品在-196℃~1，500℃的温度范围。其中一个应用就需要加热，McGinn指向制药业。他说：“当你加热药物产品时，可能会经过多态的转变。其中一些会有不同的反应。”所以药学科学家可能要将样品暴露在一系列的温度范围中，以寻找转变点。在另一个例子中，研究者可能仅需要在成像实验中让细胞样品维持在体温环境中。

一些应用甚至需要更高水平的环境控制，科学家可以利用由先进显微镜公司提供的平台式孵育器获得，其中包括一个可控环境的培养室。“这一设备本质上是EVOS荧光显微镜的插件。”生命科技公司产品经理Hans Beernink说，“它被整合到显微镜中，由软件所控制。”它可以控制其温度、湿度、甚至是气体，如氧气。

 

除了要保持细胞的健康状态，活细胞成像也带来了其他独特的挑战。一些科学家必须克服光学上的障碍，另一些则偏向于机械问题。

独特的光学因子开始在活细胞成像中起作用。由于物镜最初是为固定样品所设计的，与活细胞相比具有不同的光学特性，这就造成了对于新的显微镜解决方法的需求。加拿大安大略省列治文山的奥林巴斯加拿大公司科学仪器部市场经理Andrew Millar说：“我们有机硅浸渍的物镜就是为成像活细胞所设计的。”他接着说，“当使用有机硅浸没光学后，从活细胞收集的成像更加明亮，分辨率更高。”这些物镜可以达到30倍、40倍和60倍，可以配在任何奥林巴斯的显微镜上。因为有机硅浸渍介质的折射参数非常类似于活细胞的折射参数，它们提高了成像的质量。

活细胞成像技术包含了广泛的应用，其中有些却十分特殊。例如，在电生理学领域，一旦你将玻璃电极插入所需的神经元中，你不希望任何东西碰到它，担心会突然地终止你的记录。但是如果你想要看一下旁边的物体，甚至是放入第二个电极？你不能够移动显微镜载物台，但是有些技术却可以让你将物镜重新定位，如佛蒙特州威利斯顿市MBF生物科技公司的径向移动物镜。“它能够使物镜在x和y方向上移动。”该公司总裁 Jack Glaser介绍，“样品固定不动，通过物镜移动来扫描不同的点。”Glaser接着说，RMO能够配合大部分的显微镜和物镜。“你只需要转动镜头转轮，换成RMO，旋紧旋钮，就能够使用了。”Glaser解释道。RMO配备的控制盒能够让计算机移动物镜。

 

无论科学家是在观测活细胞或固定样品，控制照明对于显微实验来说都是一个重要的方面，特别是对于如今需要多重激光来点亮样品中不同荧光标记的成像技术。“人们对他们的实验有自身的偏好和需求。”总部设在纽约州梅尔维尔的尼康仪器公司美洲市场和产品部总经理Stephen T. Ross说。

为了帮助他们实现这些需求，尼康为自己的Ti倒置显微镜研发了新的组件。例如，尼康的LU-N激光单元能够装载多达8种激光，范围是356~756纳米。“这些激光单元也能够提供多达7种不同的输出，能够与多种仪器相连，如荧光成像的光激活系统。”Ross说，“此外，这是个固态的激光系统，当它从盒子中取出时，不需要反射镜或者调解装置。”

尼康研发的L-Apps系统组件与LU-N系统一并推出。“这些应用组件能够通过我们的软件与LU-N进行协同工作。” Ross说，“这就可以接受复杂的实验，使得它们能够为不同专业水平的人们所使用。”当照亮活细胞时，激光会损伤样品。因此对于照明的控制就派上了用场。

为了真正减轻荧光成像中激光照明的潜在损伤，科学家可以使用双光子显微镜。它通过一次性利用两个光子激活荧光分子，来降低光对于样品的影响，每个只携带一个光子能量需求的约一半。为了进一步减少组织损伤，科学家可以使用能够造成脉冲非常短的激光，这也能够减少样品应用的能量。如今这种成像最快的激光能够在飞秒的范围中产生脉冲。

当问及制造大多数生命科学实验室可以使用的飞秒激光时，奥地利维也纳Femtolasers Produktions公司的总裁Andreas Stingl提到了三件事：易于使用、一万小时的生命周期和强大的构造。他说：“目前，能够在80兆赫的重复率下操作、并能在100飞秒的范围内传送脉冲的可调节钛蓝宝石振荡器，是双光子显微镜使用的标准资源。”除了造成伤害较少之外，飞秒脉冲能够比长脉冲穿透更深的组织。Stingl举例表示，“在相同的平均功率下，Sub-20飞秒脉冲比120飞秒脉冲多出160%的穿透深度。”

这种“分钟—飞秒”的转变对于成像的影响，揭示了当今显微镜技术的精确性。但是也不应过度关注如此微小的参数，以至于忽略了将所有正确的显微镜组件搭配在一起的整体需求。每一部分都很重要，它们之间的相互作用也是如此。这些都必须整合进一个系统，以满足每个科学家的需求。